1. Zusammenfassung / Abstract

Die kombinierten Verhaltensweisen der Individuen in Insektengesellschaften bestimmen das Überleben und die Entwicklung der Kolonie. Bei der Westlichen Honigbiene (Apis mellifera) umfassen die individuellen Verhaltensweisen den Nestbau, die Nahrungssuche, die Speicherung und Reifung von Nahrung, die Brutpflege, die Temperaturregulation, Hygiene und Verteidigung. Die vielfältigen Verhaltensweisen innerhalb der Kolonie, insbesondere innerhalb der Zellen, sind jedoch dem Blick entzogen und wurden bis vor Kurzem überwiegend durch Texte und Strichzeichnungen beschrieben, denen die Dynamik bewegter Bilder fehlt. In dieser Studie stellen wir eine umfassende Online-Sammlung von Videomaterial zur Verfügung, die Einblicke in das Verhalten von Honigbienen in den Wabenzellen gibt und damit einen neuen Beobachtungsmodus für die wissenschaftliche Gemeinschaft und die breite Öffentlichkeit eröffnet. Wir analysierten langfristige Videoaufzeichnungen von längs aufgeschnittenen Zellen, was uns erlaubte, seitlich in die Zellen im Inneren einer Kolonie zu blicken. Unsere qualitative Studie liefert Einblicke in Verhaltensweisen der Arbeiterinnen, darunter die Verwendung von Wachsplättchen und vorhandenem Nistmaterial zur Umgestaltung der Waben, das Einlagern von Pollen und Nektar in Zellen, Brutpflege und Thermoregulation sowie Hygieneverhalten wie Kannibalismus, Grooming und Oberflächenreinigung. Wir zeigen einzigartige Prozesse, die bislang nicht publiziert wurden, darunter das seltene Mund-zu-Mund-Füttern der Larven durch Ammenbienen sowie die Thermoregulation innerhalb von Zellen mit sich entwickelnder Brut. Dank unserer einzigartigen Videomethode können wir die Prozesse einer voll funktionsfähigen Kolonie sozialer Insekten in Klassenzimmern und Haushalten zugänglich machen und damit das ökologische Bewusstsein in der modernen Zeit fördern. Wir liefern neue Details und Bildmaterial, die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern helfen werden, ihre Hypothesen zu sozialen Verhaltensweisen zu prüfen. Darüber hinaus ermutigen wir zur nichtkommerziellen Nutzung unseres Materials zur Ausbildung von Imkerinnen und Imkern, Medien und Öffentlichkeit und dazu, im Gegenzug Aufmerksamkeit auf den allgemeinen Rückgang der Insektenbiomasse und -diversität zu lenken.

 

Einleitung

Überleben, Fortschritt und Homöostase einer Honigbienenkolonie hängen von der Koordination vorteilhafter Entscheidungen der Individuen ab. Die komplexe soziale Organisation der Honigbienen und anderer Hautflügler wurde in zahlreichen Studien untersucht (z. B. [ 1 , 2 ]). Diese Forschung, deren Geschichte mehrere Jahrhunderte zurückreicht, befasste sich mit der Arbeitsteilung, etwa dem Wabenbau, der Nahrungssuche, der Speicherung und Reifung von Nahrung, der Brutpflege, der Temperaturregulation und der Hygiene. Da die meisten dieser Verhaltensweisen jedoch dem Blick entzogen sind, existierte bislang kein didaktisch nutzbares Videomaterial.

Darwin unternahm wichtige Schritte, um die Öffentlichkeit über das Verhalten der Bienen zu informieren, und beschrieb in seinen Schriften die bemerkenswerten Aktivitäten der Honigbienen beim Wabenbau [ 3 ]. Ebenso beobachtete Huber zu Beginn des 19. Jahrhunderts den Nestbau anhand eines Beobachtungsstocks mit Glaswänden, der sich wie ein Regal öffnen ließ und ihm erlaubte, die Kolonie zu sehen [ 4 ]. Hubers Beobachtungsstock basierte auf dem von de Réaumur konzipierten, der mit seiner neuen Konstruktion das Verhalten der Honigbienen durch eine Glasfläche untersucht hatte [ 5 ]. Diese Bemühungen, in das Innere des Stocks zu blicken, begründeten eines der grundlegenden Ziele von Videoaufzeichnungen im Stockinneren.

Bis ins 21. Jahrhundert beschränkte sich verfügbares Lehrmaterial zum Bienenverhalten nahezu ausschließlich auf Texte und Illustrationen. So wurden Studien mit Beobachtungsstöcken in Werken zitiert, die folgende Prozesse beschrieben: die Produktion und Verwendung von Wachsplättchen für den Wabenbau [ 6 , 7 ], die Regression von Sammlerinnen zu Ammenbienen trotz fortgeschrittenen Alters [ 8 , 9 ] sowie die verschiedenen Tänze, mit denen Bienen kommunizieren [ 10 – 13 ]. Da Online-Streaming-Plattformen und digitale Aufzeichnungstechnik heute eine breite Verbreitung von Lehrvideos ermöglichen, sollte Bienenverhalten auch in dieser Form verfügbar gemacht werden.

Während verschiedene Verhaltensweisen außerhalb der Wabenzellen beobachtet werden können, sind jene innerhalb der Zellen – etwa die Brutpflege – schwieriger zu beobachten, da die Sicht durch Bienen blockiert wird, die ihre jeweiligen Zellen bedecken. So konnte zu Beginn des 20. Jahrhunderts die Larvenentwicklung nur untersucht werden, indem Larven aus den Zellen entnommen wurden [ 14 ]. Eine Lösung für dieses Problem wurde erstmals von Martin Lindauer vorgeschlagen [ 15 ]. Durch das Drehen von Wabenstreifen um 90°, die Regulierung des Temperaturverlusts mit einer doppelten Glasschicht und das Belassen nur eines kleinen Raums für den Wabenbau brachte er die Bienen dazu, Brut in Zellen mit transluzenter Zellwand aufzuziehen. Nach der Beobachtung dieser Zellen beschrieb Lindauer den Prozess der Brutpflege schriftlich; 35 Jahre später wurde hierfür erstmals ein analoges Videoaufnahmegerät eingesetzt [ 16 ]. Dieses Videomaterial wurde jedoch nie öffentlich zugänglich, da das Internet sich erst in den Anfängen befand.

Parallel zur Entwicklung neuer Videotechniken, die eine seitliche Sicht in die Zellen ermöglichten, entdeckten Wissenschaftler ein zuvor nicht beobachtbares Verhalten: die aktive Thermoregulation von Honigbienen in den Zellen. Infrarotkameras zeigten, dass Arbeiterinnen mit sehr wenigen Bewegungen nicht ruhten, sondern die Waben von innerhalb der Zellen erwärmten [ 17 ]. Diese Entdeckung ergänzte weitere wichtige Aspekte der Thermoregulation, die in der Vergangenheit umfassend beschrieben worden waren [ 18 - 23 ].

In einer kürzlich veröffentlichten Studie [ 24 ] kombinierten wir unsere Methode, seitlich in die Zellen zu blicken, mit langfristigen digitalen Aufzeichnungen. Wir zeichneten die Brutbereiche unserer Beobachtungsstöcke kontinuierlich auf, wodurch detaillierte Ansichten eines breiten Spektrums an Honigbienenverhalten und der Nachkommenentwicklung gewonnen wurden. Während diese Studie die Auswirkungen von Neonicotinoiden auf das Pflegeverhalten untersuchte, präsentieren wir hier quantitative und qualitative Analysen der sozialen Verhaltensweisen, die in diesen Langzeitaufnahmen beobachtet wurden. Diese Analysen umfassen die Quantifizierung von Zellbesuchen an Brut sowie zahlreiche Videosequenzen von Arbeiterinnenverhalten wie die Bildung und Nutzung von Wachsplättchen, das Einbringen und Aufnehmen von Pollen und Nektar, Brutpflege und -inspektion, Thermoregulation, Verdeckelung, Kannibalismus, Grooming und Oberflächenreinigung. Unsere Aufnahmen zeigen zudem den embryonalen Schlupf und den Larvenkokon innerhalb der Kolonie. Darüber hinaus legen wir mehrere zuvor nicht beschriebene Verhaltensweisen detailliert offen, darunter die Umgestaltung der Waben, das außergewöhnliche Mund-zu-Mund-Füttern zwischen einer Ammenbiene und einer Larve sowie das „Fangen“ von Pollen durch Sammlerinnen. Zudem erläutern wir weiter die Methode der Wasserverdunstung in Brutzellen. Erstmals stellen wir für jeden der genannten Verhaltensweisen Online-Aufzeichnungen bereit, die öffentlich zugänglich und für Bildungszwecke nutzbar sind.

 

 

Video: Wie Bienen die Brut pflegen

 

2. Material und Methoden

Beobachtungsstöcke und Aufnahmekonfiguration

Wir verwendeten kleine Beobachtungsstöcke, jeweils mit einer Population von etwa 3 000 Individuen (300 g Apis mellifera carnica) und einer Königin. Die Bienen und Schwesterköniginnen wurden jeweils aus den Völkern und dem lokalen Königinnenzuchtprogramm des Institut für Bienenkunde in Oberursel entnommen. Im definierten Brutbereich wurden die Waben um 90° gedreht, was eine Sicht in die längs aufgeschnittenen Zellen durch 4 mm entspiegeltes Glas sowie die kontinuierliche Aufzeichnung des Verhaltens der Adulten und der Nachkommenentwicklung im Inneren ermöglichte. Entweder zeichneten wir den gesamten Brutbereich mit 5,3-MP-Kameras und Objektiven mit 12,5-mm-Brennweite auf (Kamera PL-D725MU-T, PixeLINK, Ottawa mit Objektiv LM12HC, Kowa Optical Products Co., Ltd., Tokio; oder Kamera acA2500-60uc, Basler AG, Ahrensburg mit Objektiv TS1214-MP, Basler AG, Ahrensburg) oder führten Makroaufnahmen mit einer 5-MP-Kamera und einem 25-mm-Objektiv durch (Kamera acA2440-75um, Basler AG, Ahrensburg mit Objektiv TS2514-MP, Basler AG, Ahrensburg). Während in den Gesamtaufnahmen des Brutbereichs etwa 420 Zellen mit relativ niedriger räumlicher und zeitlicher Auflösung (1 bis 3 Bilder pro Sekunde) beobachtbar waren, umfassten die Makroaufnahmen einen Abschnitt von etwa 8 Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung (25 bis 30 Bilder pro Sekunde). Zur Beleuchtung nutzten wir Kuppeln, die rotes Licht außerhalb des Farbsichtbereichs der Honigbienen emittierten (λpic = 660 nm), mit einem Durchmesser von 36 cm für Übersichtaufnahmen und von 20 cm für Makroaufnahmen. StreamPix (Versionen 6.3.0.155 und 7.4, NorPix Inc., Montréal) war die verwendete Aufnahmesoftware.

 

Der Brutbereich eines Beobachtungsstocks wurde durch eine Kuppel beleuchtet, die rotes Licht außerhalb des Farbsichtbereichs der Honigbienen emittierte. Die Kuppel war eine Metallschüssel mit 20 cm Durchmesser, innen mit mattem weißem Lack gestrichen, und hatte oben ein großes Loch für das Kameraobjektiv.  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0247323.g001

Abb. 1. Konfiguration der Makro-Videoaufzeichnung.

 

Quantitative Analyse von Zellbesuchen während der Entwicklung von Arbeiterinnen

Wir verwendeten Daten und Grundprinzipien der in [ 24 ] beschriebenen Methode, um in der vorliegenden Studie Dauer und Tiefe der Besuche von Arbeiterinnen in einer Brutzelle zu untersuchen. Wir projizierten Videos (2D + Zeit) in Bilder (1D + Zeit), indem wir die Helligkeit der zentralen Pixel von Zellen – vom Zellboden bis zum Eingang – über die Zeit concatenieren (siehe https://www.nature.com/articles/s41598-020 -65425-y/chiffres/1 ). Die Bienen waren dunkler als das umgebende Wachs der Zelle, und mit einem Grauschwellwert konnten wir Ereignisse detektieren. Für jedes Ereignis bestimmte der in [ 24 ] beschriebene Algorithmus die Gesamtdauer. Die zeitliche Auflösung betrug in diesen Experimenten eine Sekunde (Aufzeichnungen aller sichtbaren Zellen im Brutbereich).

 

3. Ergebnisse und Diskussion

 

4. Bewegungen der Eier und Schlupf der Larven

Nach der Eiablage ( Video S1 ) bleibt das Ei bis zum Schlupf der Larven unbeweglich.

 

Video S1. Entwicklung von Arbeiterinnen der Honigbiene: Eiablage.

 

Wenn Arbeiterinnen sich so tief wie möglich in die Zellen bewegen, können Eier zur Basis der Zelle geschoben werden ( Video S2 ).

 

Video S2. Thermoregulation der Bienen: Zellbesetzung.

 

Arbeiterinnen können sich in Zellen bewegen, um Wärme innerhalb der Wabe zu konservieren (Gruppierung) oder zu erzeugen (direkte Inkubation). Dabei bleiben die Arbeiterin und ihre Antennen unbeweglich. Diese Beobachtung stimmt mit früheren Annahmen überein, wonach ein „Kippen“ nicht Teil des normalen Prozesses der embryonalen Entwicklung ist [ 25 ] (vgl. kein Kippen in Video S3 in [ 24 ]]). 

 

Video S4. Arbeiterinnenentwicklung der Bienen: Schlupf der Larven.

 

Beim Schlupf werden die Eihäute vollständig aufgelöst [ 25 ]. Die erste Fütterung erfolgt 95,2 ± 11,3 (Mittelwert ± SEM ; n = 86) Minuten nach dem Schlupf der Larve.

 

5. Inspektion, Fütterung und Kokonbildung der Larven

 

 

Inspektionen umfassen die Aufnahme und Verarbeitung sensorischer Informationen, um Zellinhalt, Position, Zustand und Alter der Brut usw. zu bestimmen. Das wichtigste Merkmal von Inspektionen ist die häufige Bewegung der Antennen. Bei Aufwärm- oder Ruheverhalten, die durch die Frequenz abdominaler Pumpbewegungen unterschieden werden können [ 17 ], sind keine Antennenbewegungen der Arbeiterin vorhanden ( Abb. 2 , Video S2 ). Inspektionen, denen keine weiteren Verhaltensweisen folgen, treten entweder sehr kurz auf – wobei die Arbeiterin kaum in die Zelle eindringt – oder über relativ lange Dauer, was häufiger in Zellen mit sehr jungen Larven vorkommt ( Video S3 ).

Abb. 2. Unterschiede in der Ausrichtung des Kopfes bei verschiedenen Aufgaben beim Eintritt in die Zelle. Alle Zeichnungen in diesem Artikel stammen von Nastasya Buling.  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0247323.g002

 

In unserer quantitativen Analyse der Zellbesuche in einer Zelle mit sich entwickelnden Larven war die durchschnittliche Anzahl kurzer Ereignisse (< 10 Sekunden) zehnmal höher als die Ereignisse längerer Dauer ( Abb. 3B ). Über die sechs Tage der Larvenentwicklung (vom ersten bis zum letzten Füttern) detektierten wir 13 972 ± 617 Ereignisse in der Zelle (Mittelwert ± SEM, n = 52 in 3 Kolonien). Die Anzahl der Ereignisse stieg von 2 129 ± 186 am ersten Tag der Larvenentwicklung auf 2 497 ± 206 am zweiten Tag ( Abb. 3A). Ähnliche Zahlen wurden am dritten (2 461 ± 154) und vierten (2 436 ± 115) Tag gezählt. Die meisten Ereignisse beobachteten wir am fünften Tag (3 065 ± 143) und die wenigsten am sechsten Tag (1 383 ± 154). Dieser deutliche Rückgang der Ereignisse am letzten Tag der Larvenentwicklung wurde durch die zunehmende Wahrscheinlichkeit verursacht, dass Arbeiterinnen die Zelle verstopften. Im Gegensatz dazu war die mittlere Besuchsdauer am ersten (17,0 ± 3,3 Sekunden) am höchsten und am letzten Tag der Larvenentwicklung (5,3 ± 0,3 Sekunden) am niedrigsten.

 

Die Larvenentwicklung wurde in sechs Tage der Larvenentwicklung unterteilt. A. Während die mittlere Anzahl der Besuche vom ersten bis zum fünften Entwicklungstag zunahm, nahm die mittlere Besuchsdauer in diesem Zeitraum um zwei Drittel ab. B. Kurzzeitige Besuche (< 10 Sekunden) waren zehnmal höher als die kombi